石蜡包埋组织样品制备方法

                                           Yuanmu

    组织采集后，经固定、保存、石蜡包埋、切片、展片、烤片，方可进行HE染色（或其它化学染料染色）及免疫抗体标记。以下操作依据组织大小及致密程度而定

1、组织的采集、固定和保存：

可依据实验目的及组织的特点而考虑采用不同的固定和保存方法。此处只介绍实验室常用方法。

采取组织后，4%多聚甲醛（4%PFA）4°C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜，PBS缓冲液洗三次，每次10min至1小时，于30%、50%乙醇中各10 min至1小时，4°C保存于70%乙醇中。

2、组织的包埋、切片、展片及保存：：

  固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54°C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10mm，贴于处理过的干净载玻片上，34°C烤片过夜，之后收集于载片盒中，4°C密封保存。

    石蜡包埋：

保存于4°C 70%乙醇中的组织样品

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  80%乙醇  15 min

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  95%乙醇 15 min      

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 100%乙醇  15min ´ 2

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1/2乙醇1/2二甲苯 15 min

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        二甲苯透明  5-10 min

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1/2二甲苯1/2石蜡 30 min

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    石蜡（1）  1.5hr

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        石蜡（2）  1.5-2.5hr

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石蜡（3）  包埋

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4°C保存

3、石蜡组织切片的免疫标记：

切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，即可进行免疫反应，操作步骤与冰冻组织切片的反应方法相同。

石蜡组织切片脱蜡、复水步骤：

      密封保存于4°C的组织切片

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     二甲苯(1)  10 min

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     二甲苯(2)  10 min

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     二甲苯(3)  10 min

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1/2二甲苯1/2乙醇  15 min

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    100%乙醇  5 min

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     95%乙醇  5 min

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     80%乙醇  5 min

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     70%乙醇5 min

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      50%乙醇  5 min

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     30%乙醇  5 min

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        d2H2O  5 min

4、石蜡组织切片的HE染色：

   切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，于苏木精中室温染色5-20 min，迅速用水冲洗切片，至组织切片变蓝，镜检。用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1～2秒钟，也可用50ml H2O中加一滴氨水分色，效果亦好（如染色程度恰好，也可省略分色步骤）。之后用流水冲洗切片，直至切片变蓝，此称蓝化。切片经梯度乙醇至95%乙醇中，于0.5%伊红中染色1～5秒或更长时间，95%乙醇洗去残色，若颜色太深，可在低浓度的乙醇中脱色，镜检。无水乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。普通光镜观察，室温干燥条件下保存染色切片。

石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水

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      苏木精 室温5-10 min 

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        H2O  迅速冲洗

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 0.1%盐酸乙醇  1-2 sec

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          流水滴洗

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         30%乙醇  1 min

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         50%乙醇  1 min

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        70%乙醇  1 min

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        80%乙醇  1 min

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        95%乙醇  1 min

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       伊红A液  1min

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