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酵母质粒提取方法和步骤

作者：上海远慕生物科技有限公司 2016-06-15T00:00 (访问量:7682)

酵母质粒提取方法和步骤

酵母质粒提取可以用试剂盒提取，也可以直接用裂壁酶处理后采用碱裂解法提取质粒。推荐使用索莱宝供应的酵母质粒提取试剂盒，无需使用酚、氯仿等有毒试剂，操作安全。下面我们就用上海远慕生物酵母质粒提取试剂盒为例讲解酵母质粒提取方法和步骤。

1. 接种单菌落(待检测酵母细胞)于25mLYNB(补加氨基酸营养物)培养基中，30℃振荡培养隔夜。

2.第二天取一滴菌液于进行显微镜下观察,目镜用16,物镜用40倍观察细胞壁破碎前的状态,其成杆状,流动性比较下.

3.取10ml的培养酵母菌液,5000g离心3min,弃上清液.加入5ml的1倍TE悬浮.

4.将悬浮液倒入高压破壁仪的样品管中,利用高压破碎机进行破碎细胞壁,压力加到20Mpa,停留15s,降压,反复来回压3次.取出细胞液,取一滴于显微镜下观察,如果细胞呈不规则的球状时,而且其流动性比较大,说明其细胞壁已经破碎成为原生质体.

5.取2个EP管,每管加入1.5ml上述的细胞液,12000g离心5min,收集原生质体.弃取上清液,每管加入300ul10%的SDS溶液,混匀冰浴5min,进行破原生质体.

6.然后加入150ul的tris饱和酚,和150ul的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1),混匀,12000g,离心10min.

7.将水相移到另一EP管中,加入等体积的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1), 混匀,12000g,离心10min.

8. 将水相移到另一EP管中,加入1/10体积的3M KAC溶液和2倍体积的无水乙醇,放入-20℃冰箱中

9.1h,12000g离心10min,倒出乙醇,等干燥后加入1ml的70%的无水乙醇,混匀,12000g,离心10min.

10.弃去乙醇,等室温干燥后,每管加入20ul的TE溶液(如要去处RNA酶,加入1ul的100mg/ml浓度的RNA酶),放入-20℃冰箱即可.

11.跑电泳进行检测是否从酵母菌中提出质粒了。

以上是用酵母质粒提取试剂盒提取方法和步骤，如果还有不理解地方可以拨打索莱宝技术支持电话021-51829250.远慕生物为您提供真诚技术服务。

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