【枢密新成果】用于制备乙肝动物模型的“rAAV8-1.3xHBV”
一、 背景
乙肝病毒 (Hepatitis B virus , HBV) 属于嗜肝DNA病毒科 (Hepadanaviridae)，具有很强的感染性，其基因组为松散的环状双链DNA (relaxd circular DNA, RC DNA)，通过在宿主细胞核内形成共价闭环的DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA) 作为转录模版，形成乙肝病毒扩增所必需的前基因组RNA (pregenomic RNA, pgRNA)，再依次经反转录形成负链DNA，DNA复制形成双链DNA，完成病毒基因组的扩增过程[1]。慢性乙肝病毒感染可导致严重肝脏病变或衰竭，甚至造成癌症。虽然通过接种乙肝疫苗可以有效预防HBV的感染，但现有疗法不能完全清除病毒，全世界仍有约2.57亿（3.5%）人口感染HBV，其中非洲、中东、中国和东南亚以及西太平洋地区感染率较高，共计约2.35亿人口，存在巨大的未被满足的需求[2]。
现有乙肝治疗药物主要为逆转录酶抑制剂和干扰素，需长期用药，一旦停止病毒就会重新爆发。2018年11月，FDA发布的抗乙肝病毒感染药物开发指南，提出开发新型乙肝疗法的目标是“在治疗结束后较低的病毒复发和肝脏疾病进展风险”[3]，这意味着临床前药物评估需要在能模拟乙肝病毒长期感染的动物模型中进行。然而乙肝病毒宿主范围狭窄，不容易直接建立长期感染的动物模型。目前广泛采用重组腺相关病毒 (adeno-associated virus, AAV) 载体携带乙肝病毒体内表达的方式实现长期感染的动物模型。
二、 rAAV8-1.3xHBV简介
枢密科技利用AAV基因组能在宿主细胞中稳定存在的特性以及8型AAV嗜肝性的特点，开发了携带1.3拷贝HBV全长基因组的腺相关病毒产品rAAV8-1.3xHBV（血清型：ayw，基因型：D）[4]，其模拟了pgRNA的形成，更贴近病毒天然的生活周期，能稳定的建立乙肝病毒长期感染的状态。通过小鼠尾部静脉注射制备HBV持续性感染的动物模型应用于HBV药物评价和筛查的研究。此产品线可方便、快速的为科研院校以及工业客户等提供稳定的、优质的产品服务。
1. 分子构建
图1. 用于建立乙肝病毒感染动物模型的AAV-1.3xHBV产品基因组结构示意图，包含完整乙肝病毒基因组的4个开放读码框和上游重复区域。
1. 效果验证
C57小鼠静脉注射总量分别为2.3x1010vg，5x1010vg和10x1010vg按比例稀释的病毒液，体积为200uL。 眼眶采血检测血清中乙肝病毒标记物HBsAg、HBeAg和DNA含量，连续观察7周。
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图2. 用AAV-1.3xHBV建立小鼠乙肝病毒长期感染模型效果测试。A-C，不同剂量病毒尾静脉注射，检
测血清乙肝病毒标记物含量，每个剂量组检测5只小鼠。D-F，最高剂量组5只小鼠乙肝病毒标记物个体检测结果
1. 乙肝病毒感染小鼠模型比较
目前用于研究的乙肝动物模型有HBV树鼩模型、土拨鼠肝炎病毒和鸭肝炎病毒，但这些动物并未建立纯系品种，难以标准化，且后两者由于和人HBV亲缘性较远，难以模拟人感染HBV的病理特征。小鼠缺乏HBV受体，不能用直接感染的方法建模，目前常用的小鼠乙肝病毒感染模型各有优劣，如下表所示：
表1. 小鼠乙肝病毒感染模型比较
一、 枢密优势
枢密的生产系统、质控系统都严格按照标准文件执行，可确保产品的质量和批次间的稳定性。rAAV8-1.3xHBV在生产的过程中采用的系统不含人源细胞系，避免了生产过程中产生野生型HBV病毒颗粒的风险，安全性高，此系统不仅可以实现大规模的生产而且具有较高的产率和稳定性。因此，枢密开发的rAAV8-1.3xHBV既能满足基础科研，也能满足工业客户的要求。
腺相关病毒产品采用碘克沙醇密度梯度离心纯化，通过荧光定量PCR检测AAV基因组ITR序列测定滴度，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染检测产品纯度。
图3. rAAV8-1.3xHBV凝胶电泳银染。AAV的外壳由VP1、VP2、VP3三种蛋白按1:1:10比例组成，大小分别是87 KD、73 KD、62 KD，三条带浓度越接近上述比例，病毒质量越好。
一、 使用环境及注意事项
Ø 重组腺相关病毒属于复制缺陷型的假病毒载体，但rAAV8-1.3xHBV携带致病基因，其病毒产品和受感染的动物对人具有感染性和致病性，应在生物安全二级条件下操作使用，运输过程也需做到隔离防护。
Ø 操作人员需要经过专业的生物安全培训并获得生物安全培训合格证，严格按照生物安全实验规程和手册进行操作。建议操作人员接种乙型肝炎疫苗以获得乙肝免疫能力。
Ø 感染了rAAV8-1.3xHBV的小鼠排泄物等可能含有HBV病毒，该HBV病毒对包括人在内的灵长类动物有潜在感染性和致病性，对树鼩、鸭子等动物的均具有感染性，故实验动物及废弃物的处理需要严格遵循生物安全实验规程。
Ø 该病毒产品及其动物模型的使用单位应该有生物安全二级实验室资质。
二、 运输及保存方法
Ø 病毒采用干冰运输，通常1-2天送达。
Ø 病毒可在4℃短期保存1-2周，但滴度会有4-5倍的降低。长期保存需存放于-80℃。每冻融一次，病毒滴度降低10%左右，应避免反复冻融。
Ø 理论上，病毒可于-80℃保存6个月以上，但病毒储存时间超过6个月后，建议在使用前重新测定滴度。
Ø 避免细菌、蛋白酶等污染。
欢迎新老客户前来垂询。